Spermatozoi con DNA intatto indicano il potenziale di fecondazione

Le tecniche di riproduzione assistita sono diventate il trattamento di scelta in molti casi di infertilità; tuttavia le attuali percentuali di successo per queste procedure rimangono ancora subottimali.
Molte possono essere le ragioni degli scarsi risultati rispetto all’attesa. Tra i tanti motivi che si possono considerare è importante la valutazione dello stato della fertilità maschile ,spesso scarsamente valutata . Il ruolo degli spermatozoi nel fallimento della PMA è stato trascurato, forti prove suggeriscono che una corretta selezione degli spermatozoi si tradurrà in percentuali di successo migliorate. Ad esempio, gli spermatozoi con alterazione degli istoni nucleari tendono a condensazione cromosomica prematura, che è stata identificata come una delle prevalenti cause di fallimento della fecondazione.

Bisogna considerare con maggior attenzione la componente maschile che, in fin dei conti, è coinvolta per il 50 % , ma sulla quale come indagini spesso ci si limita ad un semplice spermiogramma, peraltro non sempre effettuato da personale specializzato nella diagnostica andrologica .
Va considerato che alcuni spermatozoi possono trovarsi in apoptosi nonostante il loro aspetto normale, e ciò può quindi essere parzialmente responsabile del basso tasso  di fecondazione e di sviluppo della blastocisti o di bassi tassi di gravidanza e aborti.
La morte cellulare programmata (apoptosi) è una modalità basata su un meccanismo genetico che induce una serie di alterazioni cellulari, morfologiche e biochimiche che portano la cellula all’eliminazione, tale processo è normale per il ricambio delle cellule, elimina le cellule vecchie o danneggiate e le sostituisce con cellule nuove e sane.
Questo fenomeno però si può alterare e quando si verifica durante nella spermatogenesi si possono avere gli effetti negativi dell’apoptosi degli spermatozoi, in particolare portando alla frammentazione del DNA.
Varie tecniche di preparazione degli spermatozoi si utilizzano nelle procedute di PMA per selezionare gli spermatozoi migliori.
Le tecniche di routine per la preparazione degli spermatozoi dipendono principalmente dai parametri di motilità e morfologia e dall’ approccio di sedimentazione o migrazione per separare gli spermatozoi in base alla loro motilità o densità . Tuttavia, eventi molecolari come l’apoptosi degli spermatozoi non sono sempre valutati, e possono avere un impatto negativo sui risultati finali.
La presenza di marcatori di apoptosi nello sperma umano portano al fallimento della fecondazione in vivo e in vitro.
Uno dei primi eventi apoptotici specifici riportati nell’uomo è l’esternalizzazione del fosfolipide fosfatidilserina (PS) dalla sua normale posizione nel foglietto interno della membrana plasmatica verso alla superficie esterna dello spermatozoo.
La frammentazione del DNA spermatico è una caratteristica apoptotica tardiva.
Lo sviluppo di nuovi protocolli per la selezione degli spermatozoi basati sulla presenza di marcatori e manifestazioni simili all’apoptosi dovrebbe migliorare le percentuali di successo in PMA.
L’inclusione di spermatozoi non apoptotici è uno dei prerequisiti per il successo della fecondazione.
Sebbene l’apoptosi sia un fenomeno fisiologico in corso che mantiene il numero di cellule germinali all’interno della capacità di supporto delle cellule del Sertoli, l’apoptosi deregolata è stata associata alla presenza di spermatozoi anomali nello sperma in termini di conta, motilità e morfologia.
Esternalizzazione della fosfatidilserina
Negli spermatozoi con una membrana plasmatica intatta, il fosfolipide PS si trova all’interno
della membrana plasmatica. Il fosfolipide PS ha un’affinità elevata e selettiva per l’annessina V, un una proteina legante i fosfolipidi . L’annessina V non può passare attraverso una membrana plasmatica intatta;
quindi il legame dell’annessina V agli spermatozoi caratterizza un’integrità funzionale disturbata del
membrana. Il legame è dovuto alla traslocazione di PS dal foglietto interno a quello esterno di
membrana plasmatica con conseguente esternalizzazione di PS sulla superficie esterna. Questo spostamento di PS è una delle prime caratteristiche rilevabili delle cellule che subiscono la fase terminale dell’apoptosi . PS si correla negativamente con la motilità degli spermatozoi.
L’Integrità ridotta della membrana spermatozoica è più frequente negli spermatozoi di uomini infertili, e questo e la ridotta integrità contribuisce alla sterilità nonostante i normali parametri spermatici di routine

Disfunzione mitocondriale

Negli esseri umani, i mitocondri degli spermatozoi sono suscettibili agli stimoli apoptotici a causa del loro
compartimentazione all’interno della regione del tratto intermedio. Il Potenziale di membrana mitocondriale intatto (MMP) è essenziale per la motilità degli spermatozoi , la sua interruzione è
considerata un marcatore chiave per la cascata di segnalazione dell’apoptosi .
Si è potuta trovare una forte correlazione tra potenziale di membrana e livelli di frammentazione del DNA negli spermatozoi umani.
A sostegno dell’implicazione dell’apoptosi nell’infertilità maschile, sono stati rilevati danni da PS, disfunzione mitocondriale e DNA a livelli significativamente più alti con un ruolo documentato dell’apoptosi.
I campioni di spermatozoi di pazienti infertili si è visto essere caratterizzati da elevato numero di cellule con caspasi attivate, specialmente nei residui citoplasmatici, con un forte correlazione con PS .

Cascata dell’apoptosi negli spermatozoi umani.

Le caspasi sono enzimi implicati nell’apoptosi cellulare. Si ritiene che l’attivazione della caspasi sia un punto ben definito di non ritorno per la progressione dell’apoptosi, tra cui la frammentazione del DNA. le caspasi svolgono un ruolo centrale nel processo apoptotico che porta alla frammentazione del DNA .
L’attivazione della deossiribonucleasi attivata dalla caspasi è integralmente coinvolta nella degradazione del DNA. Sia così lo smontaggio finale della cellula generando la rottura del filamento di DNA.
E’ stata osservata una significativa correlazione positiva tra caspasi 3 nel tratto intermedio dello sperma e frammentazione del DNA in campioni di sperma a bassa motilità, suggeriscono che i meccanismi apoptotici caspasi-dipendente potrebbero avere origine nella gocciolina citoplasmatica o all’interno dei mitocondri e nel nucleo.

Origine del danno e patogenesi del DNA degli spermatozoi

Lo stress ambientale, le mutazioni genetiche e le anomalie cromosomiche possono disturbare i delicati eventi biochimici che si verificano durante la spermatogenesi portando a una struttura anormale della cromatina che è incompatibile con la fertilità.
Anomalie e danni al DNA potrebbero verificarsi al momento della condensazione del DNA nella testa dello spermatozoo o essere il risultato della spermatogenesi a monte, oppure, in alternativa, potrebbe essere il risultato di un danno indotto dai radicali liberi o di una conseguenza dell’apoptosi. Tuttavia, i meccanismi esatti con cui la cromatina si altera non è stato ancora compreso con precisione.

Il coinvolgimento dello stress ossidativo
La generazione di specie reattive dell’ ossigeno (ROS) nel tratto riproduttivo maschile è potenzialmente tossica per la qualità e la funzione dello sperma , molti dati indicano che sono presenti alti livelli di ROS dal 25% al 40% in campioni di uomini infertili .
Due fattori proteggono il DNA dello sperma dall’insulto ossidativo: il caratteristico confezionamento stretto del DNA e gli antiossidanti presenti nel plasma seminale , tuttavia, lo stress ossidativo può svilupparsi a seguito di uno squilibrio tra la generazione di ROS e le attività antiossidanti endogene. Le basi del DNA sono molto suscettibili alla perossidazione. Inoltre, gli spermatozoi sono particolarmente suscettibili al danno ossidativo perché le loro membrane plasmatiche contengono grandi quantità di acidi grassi polinsaturi e il loro citoplasma contiene basse concentrazioni di enzimi antiossidanti.
Forti evidenze suggeriscono che alti livelli di ROS mediano il verificarsi di alte frequenze di rotture del DNA a singolo e doppio filamento comunemente osservate negli spermatozoi degli uomini infertili.
Studi in cui gli spermatozoi sono stati esposti a ROS prodotti artificialmente hanno portato a un aumento significativo del danno al DNA sotto forma di modifica delle basi del DNA, produzione di siti privi di basi, delezioni, frame shift, cross-link del DNA e riarrangiamenti cromosomici .
La teratozoospermia , alterazione dalla morfologia dello spermatozoo, si verifica a seguito di spermatogenesi difettosa ed è caratterizzata da una abbondanza di spermatozoi portatori di citoplasma residuo in eccesso. La conservazione del residuo citoplasmatico promuove gli spermatozoi a generare ROS endogeni tramite meccanismi che possono essere mediati dall’enzima citosolico G6PD, pertanto, i pazienti che presentano alterazioni della morfologia sono a maggior rischio di sviluppare livelli patogeni di ROS, e successivamente apoptosi e danni al DNA degli spermatozoi.
In generale, la produzione di ROS è massima negli spermatozoi immaturi di maschi con anomalie dei parametri seminali, la morfologia anormale della testa, i difetti del tratto intermedio e della coda che mostrano la stessa caratteristica.

Da : Agarwal e Said. BJU International, 2005