Biomarcatori della qualità degli spermatozoi nell’infertilità inspiegata
Il danno al DNA dello sperma umano può avere effetti negativi sull’esito riproduttivo. Uomini infertili possiedono un maggior numero di spermatozoi con DNA danneggiato.
L’infertilità maschile può avere motivi difficilmente valutabili , diversi meccanismi possono spiegare la presenza di un DNA spermatico danneggiato, quali lo stress ossidativo e l’apoptosi tra i più valutati.
L’analisi dei parametri standard del seme può a volte sembrare normale, ma non evidenziare alterazioni nello spermiogramma che possono essere valutate solo con altre indagini come Il test di frammentazione del DNA spermatico, che dovrebbe essere eseguito assieme allo spermiogramma, in particolare in presenza di un numero alterato di linfociti e di un pH oltre la norma che possono indicare la presenza di stato infiammatorio. In questo modo si ottiene un quadro più completo e, se necessario, si deve proseguire con indagini genetiche approfondite sui fattori che influenzano la fertilità maschile e che possono rivelarsi un efficace strumento diagnostico.
La maturità della cromatina spermatica e l’integrità del DNA sono prerequisiti necessari per il completamento della fecondazione e il successivo sviluppo dell’embrione . Sebbene sia possibile rilevare un livello importante di danno al DNA nucleare dello sperma negli uomini con parametri seminali normali, tale alterazione è più presente nei pazienti infertili tra gli uomini anziani ipofertili .
L’integrità del DNA e la valutazione dell’indice di frammentazione del DNA (DFI) degli spermatozoi hanno dimostrato che ci sono valori soglia di danni al DNA dello sperma, oltre i quali sono gravemente compromessi lo sviluppo dell’embrione e l’esito della gravidanza.
In tal modo il clinico è guidato sull’approccio terapeutico da seguire per il trattamento dell’infertilità maschile, secondo il livello di maturità della cromatina spermatica e dell’integrità del DNA .
la fertilità non si basa solo sul numero assoluto di spermatozoi ma anche sulla loro capacità funzionale;
la stabilità e l’integrità del DNA spermatico servono per valutare i disturbi della fertilità e per aumentare il valore predittivo dell’analisi dello sperma per la procreazione in vivo e in vitro. Con queste nuove tecniche è stato dimostrato che anche gli uomini normozoospermici infertili, oltre a quelli con parametri seminali scadenti, hanno percentuali più elevate di spermatozoi con frammentazione del DNA rispetto agli individui che presentano normali qualità del seme .
La frammentazione del DNA spermatico può derivare da un impaccamento difettoso della cromatina durante la spermiogenesi o eccessiva produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nell’eiaculato.
In particolare in una percentuale del 5-13 % di uomini con problemi di fertilità vi è presenza di una carenza completa di protamina, tale dato può essere attribuito a un difetto della cromatina.
L’ Apoptosi durante lo spermatogenesi o rotture transitorie durante la spermiogenesi può essere un altro motivo di danno al DNA dello sperma.
Aumento del danno ossidativo al DNA e alti livelli di 8-idrossi-2′-deossiguanosina, un biomarcatore di ossidato DNA, sono stati rilevati anche nel liquido seminale di uomini infertili e la probabilità di
gravidanza è inversamente correlata con la presenza di livelli alti di 8-OH dG .
Lavori recenti suggeriscono che il danno al DNA degli spermatozoi umani è più comunemente associato ad alti livelli di ROS, principalmente come conseguenza delle goccioline citoplasmatiche trattenute
sul tratto intermedio dello spermatozoo. Questo provoca la perossidazione lipidica delle membrane cellulari, a causa dell’esposizione agli acidi grassi insaturi e ad alti livelli di ossidasi.
Quindi l’impacchettamento anomalo della cromatina, lo stress ossidativo e la scarsa integrità del DNA dello sperma sono considerate possibili cause di infertilità maschile.
Condizioni patologiche durante la spermatogenesi, la spermiogenesi e negli spermatozoi eiaculati possono essere dovute a Infezioni del tratto genitale maschile e a varicocele che sono fattori eziologici nella generazione di ROS.
Attività normale e difettosa delle Protamine
Durante la spermiogenesi (differenziazione dallo spermatide allo spermatozoo) la struttura della cromatina è ampiamente modificata. La maggior parte degli istoni specifici dello sperma sono sostituiti da proteine nucleari, a loro volta sostituite dalle protamine promuovendo così la condensazione della cromatina e la riorganizzazione del genoma
La cessazione della trascrizione è seguita dalla riparazione delle rotture del DNA e l’inizio del legame delle protamine fosforilate. Durante il passaggio dello sperma nell’epididimo, migliora la stabilizzazione del complesso nucleo-protamina.
Questa struttura compatta al momento della fecondazione uno spermatozoo sano e maturo deve decondensarsi e riorganizzarrsi in un pacchetto molto stretto che consenta di trasferire le informazioni genetiche in modo sicuro all’ovocita. L’organizzazione del DNA nucleare dello spermatozoo non solo consente il pacchetto molto stretto da trasferire, ma permette anche la trasformazione di questa struttura in una configurazione più lassa in modo che le informazioni genetiche siano facilmente accessibili all’embrione . Tuttavia, alcune regioni del Il DNA mantengono una struttura nucleosomiale durante la spermiogenesi.
Negli esseri umani, circa il 15% del DNA dello sperma è associato con istoni o altre proteine , Il restante 85% è sotto forma di complesso nucleoprotaminico altamente compatto. Sia le proteine di transizione che le protamine sono prodotti di geni unici espressi solo nelle cellule germinali maschili. Le protamine sono piccole proteine basiche che impacchettano il DNA in un volume venti volte più piccolo del nucleo delle cellule somatiche.
La specie umana ha due serie di protamine P1 e P2, il nucleo dello spermatozoo umano possiede un gruppo di quattro protamine (HP1, HP2, HP3 e HP4): protamina HP1, membro della famiglia P1 e protamine HP2, HP3, HP4, membri della famiglia P2. Entrambe le protamine sono espresse in quantità approssimativamente uguali con un rapporto medio P1/P2 di 1,0.
La Protamina P2 svolge una funzione essenziale nella fertilità maschile e rapporti P1/P2 alterati sono stati mostrati in sperma di alcuni uomini infertili con carenza di P2 nello sperma maturo, mentre le anomalie della protamina sono raramente osservate nello sperma di uomini fertili.
Nel complesso, ciò significa che il DNA nucleare degli spermatozoi eiaculati può presentare alterazioni del meccanismo di riparazione duranteil meccanismo di protaminazione e un processo di maturazione incompleto durante la condensazione della cromatina. Ridotti i rapporti protamina 1/protamina 2 si osservano in alcuni uomini infertili e sono spesso associati a gravi difetti di spermatogenesi .
Recentemente è stato suggerito che la valutazione del rapporto P1/P2 possa rappresentare un test funzionale dello sperma più accurato tra gli altri. L’espressione anormale della protamina è stata associata a basso numero di spermatozoi, ridotta motilità e morfologia alterata degli spermatozoi, ridotta capacità di fecondazione e aumento del danno al DNA dello spermatozoo .
E’ anche possibile valutare con indagini genetiche difetti genici nei geni PRM 1 -PRM2 delle protamine per comprendere l’origine del danno.
Apoptosi
L’apoptosi è un meccanismo fisiologico controllato per l’eliminazione di cellule danneggiate, complementare ma opposta alla mitosi, necessaria allo sviluppo delle popolazioni cellulari definite e il mantenimento dell’omeostasi dell’organismo durante l’età adulta. Questo processo altamente conservato, chiamato anche morte cellulare programmata può essere avviato o inibito da una varietà di stimoli ambientali.
La morte cellulare è necessaria durante il normale sviluppo per una corretta formazione dei gameti e serve a controllare l’eccessivo numero di cellule germinali eliminando l’eccedenza durante la differenziazione.
Apoptosi nell’epitelio seminifero
La morte delle cellule germinali che si verifica durante la normale spermatogenesi nei mammiferi è stata identificata essere responsabile della perdita fino a 75% del potenziale numero di spermatozoi ,infatti una parte degli spermatogoni viene eliminata dall’apoptosi e solo il 25% del previsto numero di spermatociti I è prodotto dall’originale popolazione di spermatogoni, ciò porta a concludere che la morte cellulare programmata ha un ruolo importante nella spermatogenesi.
Gli spermatozoi testicolari presentano meno danni al DNA di quelli eiaculati. Queste caratteristiche si vedono costantemente negli spermatozoi degli uomini fertili, anche se in numero ridotto rispetto a quelli prodotti da pazienti infertili.
La percentuale di spermatozoi con frammentazione del DNA presenta un aumento significativo nel seminale di pazienti con oligoastenoteratozoospermia
Lo stress ossidativo
La fonte primaria di ROS nel plasma seminale sono gli spermatozoi stessi e la presenza di leucociti polimorfonucleati. Bassi livelli di ROS sono necessari per la normale funzione di capacitazione e reazione acrosomiale degli spermatozoi.
Spermatozoi difettosi e aumento del numero di leucociti infiltranti, infiammazione che a livello del testicolo, dell’epididimo o della prostata genera alti livelli di ROS, superiori alla capacità protettiva del liquido seminale. Il conseguente stress ossidativo aumenta la possibilità di danni al DNA, che possono derivarne dalla disfunzione dello sperma a causa della scarsa qualità, della perdita di capacità di subire la reazione acrosomiale, dalla difficoltà di fusione dello spermatozoo con l’ovocita e diminuita fertilità, sia in vitro che in vivo .
La perossidazione degli acidi grassi insaturi nelle membrane dello spermatozoo e la frammentazione del DNA sono implicate nella infertilità. I ROS causano danni al DNA e interrompono la funzione degli spermatozoi. Lo stress ossidativo e l’apoptosi hanno mostrato una correlazione significativamente positiva tra produzione di ROS , stress ossidativo e danni al DNA .
I mitocondri, organelli cellulari che producono energia per la cellula, fonte fondamentale di ROS, sono coinvolti nell’attivazione di molecole pro-apoptotiche, nella frammentazione del DNA e nell’apoptosi. Mentre il danno ossidativo del DNA mitocondriale porta a una riduzione di produzione di ATP, quindi scarsa motilità, Il danno al DNA nucleare è dannoso per la morfologia e la funzione dello spermatozoo . Tutto questo che influisce sulla capacità riproduttiva. ll trattamento con antiossidanti può aiutare ridurre questo danno al DNA.
Infezioni del tratto genitale e varicocele
Le infezioni del tratto genitale possono causare danni al DNA degli spermatozoi e si associano a livelli aumentati di ROS e la temperatura intratesticolare elevata è un’altra causa di danno al DNA; è stato infatti dimostrato che l’ipertermia testicolare, sia diretta che indiretta, può causare danni al DNA attraverso un aumento del rapporto istone:protamina .
Il varicocele costituisce una grave causa di infertilità maschile sebbene sia presente anche nel 15% degli uomini che non ne subiscono danni. E’ poi importante la valutazione del grado del varicocele e da quanto tempo questo è presente.
I ROS pussono anche essere generati all’interno dei tubuli seminiferi dalle goccioline citoplasmatiche trattenute negli spermatozoi immaturi e questa sembra essere una caratteristica comune nello sperma di uomini infertili con varicocele .
Età e danni al DNA degli spermatozoi
L’avanzare dell’età paterna è stata associata a una varietà di anomalie, come la diminuzione della qualità del seme, anomalie cromosomiche numeriche e strutturali, che possono diminuire la capacità riproduttiva e aumentare la frequenza degli aborti spontanei. Gli uomini più anziani sembrano produrre più spermatozoi con DNA danneggiato provenienti dai tre principali fonti potenziali: stress ossidativo, apoptosi o impacchettamento (packaging) anormale della cromatina.
Conclusione
Analizzando l’impatto di specifici biomarcatori di protaminosi e integrità del DNA spermatico, diventa evidente il loro uso come indicatori di infertilità.
Al di là delle anomalie aumentate nei convenzionali parametri seminali, le ridotte capacità di riparazione del DNA può anche essere attribuito ad un accumulo di spermatozoi danneggiati dal DNA a causa di apoptosi carente,pertanto, la ridotta eliminazione e il successivo accumulo di spermatozoi difettosi, in concomitanza con scarsa integrità del DNA e cromatina anormale imballaggio, si traducono in uno sperma di scarsa qualità. L’ iniezione questi spermatozoi anormali in ovociti può portare al fallimento della decondensazione e della capacità fecondante degli spermatozoi.
Vi è un danno al DNA oltre il quale lo sviluppo dell’embrione e gli esiti successivi della gravidanza sono compromessi. Perciò, il rilevamento del DNA danneggiato negli spermatozoi deve essere condotto insieme all’analisi standard dello sperma, diventando uno strumento diagnostico molto efficiente per la valutazione delle patologie sottostanti e spiegare l’infertilità ritenuta inspiegabile.
Da Reproductive Biology and Endocrinology 2007, 5:36
