Tecniche di Riproduzione Assistita e rischi epigenetici nelle generazioni future

L’applicazione della tecnica ’ICSI’-intracytoplasmic sperm injection  non è esente da potenziali conseguenze dannose, come riportato da nuovi studi possibili conseguenze sulla salute della prole. Metilazione del DNA e alterazioni epigenetiche negli spermatozoi cellule di uomini infertili potrebbero aiutare a spiegare alcuni degli effetti avversi riportati negli studi ICSI sull’ salute riproduttiva nelle generazioni future. la salute dei bambini ICSI negli ultimi trent’anni sembra sostenere l’idea che potrebbe esserci un aumento del rischio di disturbi epigenetici, malformazioni congenite, alterazioni cromosomiche e subfertilità nei bambini nati a seguito dell’ICSI rispetto ai bambini concepiti naturalmente. una panoramica dei meccanismi epigenetici e delle possibili alterazioni dell’imprinting in seguito all’utilizzo dell’ART, in particolare dell’ICSI. Evidenzia anche il contributo degli spermatozoi alla regolazione epigenetica dell’embrione e i rischi delle condizioni di coltura in vitro sulla disregolazione epigenetica. Infine, riassume la letteratura riguardante i possibili disordini epigenetici nei bambini nati dopo la ART.
Il processo di fecondazione in vitro dipende principalmente da tre procedure: stimolazione ovarica(OS), fecondazione in vitro (IVF) o ICSI e coltura di embrioni. La maggior parte dei bambini sottoposti a ART sono sani . Tuttavia, studi recenti riportano che i single nati a seguito di trattamenti IVF/ICSI hanno un rischio maggiore di eventi avversi perinatali esiti, che potrebbero essere associati a disregolazione epigenetica, come anormali placentazione o basso peso alla nascita . Inoltre, c’è una crescente attenzione sul conseguenze a lungo termine sulla salute dei bambini nati con tecniche di riproduzione assistita, come suggeriscono prove limitate potenziali problemi metabolici e cardiovascolari avversi in questi bambini  rispetto a quelli  concepiti naturalmente.
La coltura embrionale estesa allo stadio di blastocisti, potrebbe promuovere effetti epigenetici avversi, considerando che si verificano quando avviene la maggior parte del processo di riprogrammazione epigenetica.
A causa dell’invasività dell’ICSI come a metodo di fecondazione, la tecnica è spesso dibattuta come potenzialmente causa di disregolazione  epigenetica. La tecnica ICSI introdotta nel 1992 che richiede l’iniezione di un singolo spermatozoo direttamente nel citoplasma dell’ovocita ha consentito agli uomini con un basso numero di spermatozoi e/o parametri spermatici anomali di diventare padri biologici .
l’ICSI è una procedura consolidata applicata in tutto il mondo per il trattamento delle coppie con infertilità. E’ l’ indicazione primaria al trattamento in circa il 30% delle coppie sottoposte ad ART.

Data l’importanza dell’epigenoma degli spermatozoi per l’embriogenesi precoce.è necessario affrontare la questione dell’utilizzo dello sperma di uomini con problemi di fertilità per l’ICSI. Circa il 15% dei casi di infertilità maschile comporta alterazioni genetiche, come  anomalie nel cariotipo  e microdelezioni sul cromosoma Y, con conseguente grave oligozoospermia e azoospermia . La regolazione epigenetica dell’attività genetica rappresenta un punto critico aspetto della funzione spermatica e relativa capacità fecondante,  l’interruzione dell’epigenoma paterno può indurre infertilità maschile e trasferire aberranti informazioni all’embrione. Un elemento chiave del controllo della funzione dei gameti maschili riguarda modificazione post-traduzionale degli istoni ( organelli su cui è arrotolato il DNA), come metilazione , acetilazione e la fosforilazione , che consente l’attivazione o la repressione del sottostante geni. Le modifiche degli istonici sono essenziali nel governare i processi cellulari, come la trascrizione, riparazione del DNA, replicazione del DNA e condensazione dei cromosomi .Un recente studio ha riportato la riduzione complessiva del’ Acetilazione H4 e alterazioni della metilazione  negli uomini astenoteratozoospermici rispetto ai normozoospermici. L’acetilazione anormale degli istoni all’interno di promotori di geni potrebbe essere associata ad un’insufficiente compattazione della cromatina spermatica, influenzando il trasferimento dei segni epigenetici all’ovocita e alla generazione futura .
La tecnologia ICSI, che trova larga applicazione per superare le forme più gravi  di infertilità maschile, potrebbe aumentare la frequenza dei disturbi dell’imprinting e avere effetti negativi influenzando l’evoluzione dell’embrione e la futura prole adottando spermatozoi immaturi che potrebbero non sono stati adeguatamente impressi o metilati.

meccanismi epigenetici
Nel 1942, Conrad Waddington sottolineò l’importanza dell’attenzione all’ambiente cambiamenti durante le prime fasi dello sviluppo dell’embrione introducendo il termine “epigenetica”, che rappresenta un meccanismo di regolazione genetica . I processi epigenetici includono la metilazione del DNA, le modifiche degli istoni e rimodellamento della cromatina. Queste modifiche possono avere conseguenze a breve o lungo termine ed essere trasmesso per mitosi da cellula a cellula e, attraverso la linea germinale, alla successiva generazione.

Il DNA racchiuso attorno agli istoni dà luogo alla formazione di nucleosomi. La particolare disposizione del DNA stabilisce se a il gene sarà trascrizionalmente attivo o silente. Porzioni altamente compattate del DNA,  chiamate eterocromatina  sono trascrizionalmente silenziate mentre tratti debolmente legati agli istoni sono chiamati eucromatina e sono trascrizionalmente attivi. L’Epigenetica controlla la compattezza e la riprogrammazione del DNA, svolgendo un ruolo vitale nella regolazione di quali geni sono attivi, quando sono attivi e in quali tessuti. Durante la gametogenesi e lo sviluppo iniziale dell’embrione in entrambi vengono introdotte radicali modifiche epigenetiche e  maschio e femmina ereditarono la cromatina come due terminali differenti.
A seguito della fecondazione dell’ovocita da parte dello spermatozoo si forma l’embrione, la prima cellula del nuovo individuo che si moltiplica sviluppa circa 200 cellule al 5°-6°giorno  prendendo il nome di blastocisti , già differenziate in due tipi: il trofettoderma (TE) e la massa cellulare interna (Inner Cell Mass), quest’ultima comprende un gruppo di cellule fissate all’interno del trofectoderma, che alla fine darà origine al feto. Le cellule TE sono quelle della blastocisti strato esterno, promuovendo il processo di impianto nel rivestimento e nella formazione dell’utero altri tessuti extraembrionali, compresa la placenta. Le cellule embrionali vengono guidate durante lo sviluppo iniziale attraverso la riprogrammazione epigenetica e successivo ristabilimento delle firme epigenetiche specifiche del tipo cellulare. Questo coincide con il periodo in cui i gameti e gli embrioni vengono coltivati all’interno del laboratorio di embriologia. Pertanto, durante questa finestra temporale critica, eventuali perturbazioni artificiali potrebbero provocare modifiche epigenetiche nella prole con la possibile formazione di alterazioni dell’imprinting e di errori di metilazione del DNA geni impressi nei bambini nati dopo la ART rispetto a quelli concepiti naturalmente. La frequenza dei disturbi dell’imprinting nei bambini nati con ART è stata trovata più alta rispetto ai bambini concepiti naturalmente, facendo concludere che un rischio maggiore di alterazioni dell’imprinting si verifica nei bambini nati da fecondazione assistita.
I cambiamenti nella metilazione del DNA con l’invecchiamento potrebbero aumentare il rischio di sviluppare disturbi dello sviluppo neurologico nella prole . Inoltre, cambiamenti nelle regioni promotrici dei geni contenenti isole CpG ( zone metilate che danno il segnale di stop o avvio della trascrizione),, negli spermatozoi di uomini più anziani potrebbero alterare la funzione dei geni associati portando alla disregolazione genica

Figura 1.

Metilazione del DNA e riprogrammazione epigenetica durante la fase iniziale dello sviluppo dell’embrione. Il genoma paterno subisce una demetilazione attiva post-fecondazione, mentre il genoma materno viene demetilato passivamente.

   Figura 2. ciclo di riprogrammazione epigenetica.
Le due principali ondate di riprogrammazione epigenetica si verificano durante la gametogenesi e dopo la fecondazione. Durante la gametogenesi, la maggior parte dei geni epigenetici parentali i segni vengono cancellati e ristabiliti al momento dell’ovogenesi e della spermatogenesi. Una seconda epigenetica L’onda di riprogrammazione avviene subito dopo la fecondazione con una demetilazione paterna rapida e attiva e una demetilazione materna più lenta e passiva. Nuovi modelli di metilazione vengono stabiliti nella blastocisti stadio nella massa cellulare interna, mentre il trofettoderma rimane relativamente non metilato.

Spermatogenesi, epigenetica e infertilità
La spermatogenesi  può essere descritta da tre fasi principali: in primo luogo, la mitosi con la moltiplicazione degli spermatogoni, poi la meiosi per ridurre gli numero di cromosomi da diploide ad aploide, e infine la spermiogenesi, che indica la riuscita maturazione degli spermatidi rotondi in spermatozoi [71]. Tutto di questi processi sono collegati tra loro e sono responsabili della normale produzione di gameti , la dinamica della riprogrammazione epigenetica e i loro sistemi regolatori sono fondamentali per la normale spermatogenesi e qualsiasi alterazione durante la spermatogenesi può causare una riduzione della quantità di sperma e qualità. Vi è una cascata di cambiamenti epigenetici durante il fasi iniziali dello sviluppo delle cellule germinali primordiali -PGC, che indicano eventuali alterazioni nella regolazione della funzione e dell’espressione genica durante la gametogenesi. Eventuali disturbi di queste regolazioni epigenetiche potrebbero provocare diversi stadi di infertilità, il che potrebbe essere trasferiti alle generazioni future. Dopo che la spermatogenesi è completata la maturazione extra avviene nell’epididimo . Tutti questi processi sono collegati tra loro e sono responsabili della normale produzione di spermatozoi
Oligoastenoteratozoospermia
l’ICSI dovrebbe essere incoraggiata soprattutto in caso di grave infertilità maschile. La valutazione degli spermatozoi con l’analisi del liquido seminale presenta dei limiti; ad esempio, non valuta la funzione e la fisiologia dello sperma e la valutazione genetica o epigenetica, Il numero, la morfologia e la motilità vengono generalmente valutati per decidere sulla procedura ICSI piuttosto che l’inseminazione IVF standard. Nella oligoastenoteratozoospermia la morfologia degli spermatozoi è un altro parametro ampiamente utilizzato per scegliere l’ICSI., utilizzata di routine nei casi di pazienti con morfologia spermatica ridotta (<5%) .l’esecuzione di ICSI o IVF non ha alcuna differenza negli esiti della gravidanza nei pazienti con teratozoospermia grave. Un altro Il parametro chiave dello sperma è la motilità e l’ICSI è stato fortemente suggerito quando ce ne sono pochi spermatozoi mobili o assenza totale di motilità degli spermatozoi nell’eiaculato (astenozoospermia
ICSI e frammentazione del DNA spermatico (SDF)
Il test di frammentazione del DNA viene applicato per valutare la rottura dei filamenti di DNA all’interno testa dello sperma. Questo test diagnostico può prevedere la fertilità e il normale sviluppo dell’embrione e gli esiti della gravidanza rispetto ai parametri di analisi dello sperma di routine .
Frammentazione del DNA spermatico (SDF) è generalmente indotto dallo stress ossidativo derivante da fattori ambientali e di stile di vita come fumare, infezioni del tratto genitale, obesità e nutrizione [101]. Inoltre, SDF lo è frequentemente rilevato negli uomini con problemi di infertilità (ad esempio varicocele) ed è più diffuso in quegli individui rispetto alle controparti fertili . Le prove scientifiche lo indicano un livello elevato di SDF compromette le probabilità di successo dopo la ART, i tassi di gravidanza clinica erano più alti nei pazienti sottoposti a fecondazione in vitro i cui partner maschi avevano bassi livelli di SDF [106]. Pertanto, sembra ragionevole suggerire ICSI piuttosto che IVF standard nelle coppie con SDF elevato. Tuttavia, un dato da considerare è il rischio di aborto spontaneo, che sembra aumentare tra coppie sottoposte ad ART che riportano spermatozoi con SDF elevato, indipendentemente dal tipo di fecondazione

Fecondazione (IVF/ICSI) e rischio di modificazione epigenetica
Tra i due metodi utilizzati IVF /ICSI per la fecondazione degli ovociti la differenza sta nell’inseminazione IVF standard dove lo sperma e l’ovocita vengono posti insieme nella stessa piastra di coltura, e lo spermatozoo farà fecondare l’ovocita da solo e la tecnica ICSI, in cui l’embriologo inietta lo spermatozoo nell’ovocita utilizzando un un microscopio invertito e un micromanipolatore rilasciarlo lentamente nel citoplasma dell’ovocita
Figura 3. Metodi di fecondazione assistita.

(a) L’iniezione intracitoplasmatica dello sperma (ICSI) coinvolge il iniezione di un singolo spermatozoo nel citoplasma dell’ovocita utilizzando una micropipetta di vetro.
(b) Normale fecondazione in vitro (IVF), in cui gli ovociti vengono incubati con gli spermatozoi in una capsula Petri e uno spermatozoo feconda l’ovocita in modo naturale.
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Il processo di fecondazione avviene in vivo nell’ovidotto della donna, segue eventi fisiologici, inclusa la selezione naturale degli spermatozoi, capacitazione, reazione acrosomiale e fusione della membrana prima che il nucleo spermatico venga rilasciato nel citoplasma dell’ovocita.

Con l’ICSI tutti questi processi vengono superati facendo nascere il dubbio che le tecniche di riproduzione assistita potrebbero alterare la riprogrammazione epigenetica e infine lo sviluppo. La regolazione epigenetica potrebbe essere modulata da fattori esterni ed interni, inclusa l’esposizione ambientale, alimentazione e stress. Su questa base, le condizioni di infertilità maschile influiscono sulla qualità dello sperma è stato suggerito che influenzino l’epigenoma degli spermatozoi. Infatti, metilazione aberrante del DNA ai geni impressi è stato associato a spermatogenesi anormale e maschile fattore di infertilità. È stata collegata l’ipometilazione del DNA nel locus del gene H19 negli spermatozoi all’oligozoospermia e all’azoospermia . Quindi gli spermatozoi di pazienti infertili potrebbe avere maggiori probabilità di trasmettere impronte errate ai loro prole , suggerendo una correlazione tra genomica aberrante imprinting e ipospermatogenesi. Gli spermatozoi di uomini oligozoospermici potrebbero comportare un rischio maggiore di trasmettere alterazioni dell’imprinting. ICSI potrebbe superare l’infertilità nei casi di cui sopra, ma  con il rischio di trasferire le alterazioni all’epigenoma dell’embrione che potrebbe ereditare le anomalie per via paterna.
Alcuni studi hanno segnalato difetti di metilazione del DNA negli embrioni generati mediante ART ipotizzando che il processo stesso di fecondazione artificiale potrebbe essere la causa che influenza i processi di metilazione  incluso, ad esempio, l’ambiente ormonale alterato, l’uso di gameti epigeneticamente immaturi per la fecondazione e alle condizioni di coltura dell’embrione .

Imprinting e Rischi associati alla coltura in vitro

E’ necessario comunque comprendere meglio se gli errori epigenetici sono imputabili alla condizione intrinseca di infertilità o a fattori di rischio ambientali e di stile di vita portati dalla padre o dalla madre dovuti a disturbi dell’imprinting.
L’imprinting negli ovociti e negli embrioni è sensibile ai cambiamenti ambientali. I segni epigenetici vengono acquisiti durante la prima fase della gametogenesi, la formazione, e migrazione delle PGC- cellule germinali primordiali (che origineranno i gameti ) nella cresta gonadica , e successivamente durante la prima giorni di sviluppo dell’embrione. La corretta definizione dei modelli epigenetici è essenziale per lo sviluppo dell’embrione. Infatti, la tipica valutazione morfologica dei gameti e la qualità degli embrioni durante la PMA non può identificare alterazioni epigenetiche.

L’uso eccessivo dell’ICSI dovrebbe essere attentamente valutato, date le sue potenzialità per rischi genetici ed epigenetici. Prove “limitate” suggeriscono che i bambini nati in seguito alla procedura ICSI hanno un rischio aumentato di malformazioni congenite, anomalie cromosomiche e profili ormonali riproduttivi alterati rispetto ai bambini concepiti naturalmente. Il legame tra PMA (riproduzione medicalmente assistita), compresa l’ICSI e modificazioni epigenetiche che aumentano il rischio delle malattie nella prole, sia nella prima infanzia che in età adulta, rimane ancora non del tutto chiaro .

Sicuramente però l’utilizzo di queste tecniche di riproduzione assistita hanno permesso la nascita di molti bambini che non sarebbero mai nati, hanno permesso il desiderio di genitorialità e quindi una piccola percentuale di eventuali alterazioni epigenetiche non deve portare al non utilizzo delle tecniche, ma allo sviluppo di studi per una maggior comprensione dei meccanismi sottesi all’embriogenesi e di metodi che permettano la diminuzione del rischio.

Tratto da J. Clin. Med. 2022, 11, 2135 Romualdo Sciorio – Sandro C. Esteves